В 1823 году (в возрасте 14 лет) Пирогов поступил своекоштным студентом на Медицинский факультет Императорского Московского университета (в прошении указал, что ему шестнадцать лет, добавив два года к своему возрасту). В этот период семья Пироговых крайне бедствовала, у Пирогова не было студенческого мундира, и чтобы скрыть это, он сидел на лекциях в шинели, страдая от жары. В университете слушал лекции Х. И. Лодера, М. Я. Мудрова, Е. О. Мухина, которые оказали значительное влияние на становление научных взглядов Пирогова. В 1828 году окончил отделение врачебных (медицинских) наук университета со степенью лекаря и был зачислен в воспитанники Профессорского института, открытого при Императорском Дерптском университете для подготовки будущих профессоров российских университетов. Занимался под руководством профессора И. Ф. Мойера, в доме которого познакомился с В. А. Жуковским, а в Дерптском университете подружился с В. И. Далем.

В 1833 году, после защиты диссертации (тема: «Является ли перевязка брюшной аорты при аневризме паховой области легко выполнимым и безопасным вмешательством?») на степень доктора медицины был направлен для учёбы в Берлинский университет вместе с группой из одиннадцати своих товарищей по Профессорскому институту (среди которых — Ф. И. Иноземцев, П. Д. Калмыков, Д. Л. Крюков, М. С. Куторга, В. С. Печерин, А. М. Филомафитский, А. И. Чивилёв).

После возвращения в Россию (1836) Пирогову было предложено выбрать университет, в котором он пожелал бы получить профессорскую кафедру. Пирогов выбрал Московский университет, но по дороге домой он заболел и надолго задержался в Риге. Тем временем кафедра хирургии на Медицинском факультете Московского университета, к великому огорчению Пирогова, оказалась занята. Пирогов был избран (в возрасте двадцати шести лет) профессором кафедры теоретической и практической хирургии Императорского Дерптского университета, где он стал первым русским профессором, возглавившим кафедру.

В 1841 году Пирогов был приглашён в Петербург, где возглавил кафедру хирургии в Императорской Медико-хирургической академии. Одновременно руководил организованной им из 2-го Военно-сухопутного госпиталя клиникой госпитальной хирургии. Поскольку в обязанности Пирогова входило обучение военных хирургов, он занялся изучением распространённых в те времена хирургических методов. Многие из них были им коренным образом переработаны. Кроме этого, Пирогов разработал ряд совершенно новых приёмов, благодаря чему ему удавалось чаще, чем другим хирургам, избегать ампутации конечностей. Один из таких приёмов до настоящего времени называется «операцией Пирогова».

В поисках действенного метода обучения Пирогов решил применить анатомические исследования на замороженных трупах. Этот прием был впервые описан нидерландским профессором анатомии и хирургии Питером де Римером и опубликован на голландском и французском языках в 1818 году, однако Пирогов изобрел методику независимо от нидерландского коллеги и назвал ее «ледяной анатомией». Так родилась новая медицинская дисциплина — топографическая анатомия. По результатам этих исследований им в 1859 году в Санкт-Петербурге был опубликован первый анатомический атлас на латинском языке под заглавием «Anatome topographica sectionibus per corpus humanum congelatum triplici directione ductis illustrata» («Топографическая анатомия, иллюстрированная разрезами, проведёнными через замороженное тело человека в трёх направлениях»), ставший незаменимым руководством для врачей-хирургов. Этот атлас и предложенная Пироговым методика стали основой всего последующего развития оперативной хирургии.

В 1846 году Пирогов был избран членом-корреспондентом Императорской Санкт-Петербургской академии наук (ИАН).

В 1847 году Пирогов уехал в действующую армию на Кавказ, так как хотел проверить в полевых условиях разработанные им операционные методы. На Кавказе он впервые применил перевязку бинтами, пропитанными крахмалом; крахмальная перевязка оказалась удобнее и прочнее, чем применявшиеся раньше лубки. В том же году Пирогов впервые в истории медицины провёл операцию с открытым Уильямом Мортоном в 1846 году эфирным наркозом в полевых условиях (при осаде аула Салты), выполнив впоследствии около десяти тысяч таких операций. В октябре 1847 года Пирогов получил чин действительного статского советника.

• Первая жена (с 11 ноября 1842 года) — Екатерина Дмитриевна Березина (1822—1846), представительница древнего дворянского рода, внучка генерала от инфантерии графа Н. А. Татищева и дочь отставного штабс ротмистра. Умерла в возрасте 24 лет от осложнений после родов.
  • Сын — Николай (1843—1891), физик.
  • Сын — Владимир (1846 — после 13 ноября 1910), историк и археолог. Профессор Императорского Новороссийского университета на кафедре истории. В 1910 году временно проживал в Тифлисе и присутствовал 13—26 ноября 1910 года на экстраординарном заседании Императорского кавказского медицинского общества, посвящённом памяти Н. И. Пирогова.
• Вторая жена (с 7 июня 1850 года) — Александра фон Бистром (1824—1902), баронесса, дочь генерал-лейтенанта А. А. Бистрома, внучатая племянница мореплавателя И. Ф. Крузенштерна. Свадьбу играли в гончаровской усадьбе Полотняный Завод, причём таинство венчания было совершено 7/20 июня 1850 года в местном Преображенском храме. Долгое время Пирогову приписывали авторство статьи «Идеал женщины», которая представляет собой выборку из переписки Н. И. Пирогова с его второй женой. В 1884 году трудами Александры Антоновны была открыта хирургическая лечебница в Киеве. Скончалась в ночь на 1 июля 1902 года в селе Вишня, после продолжительной болезни.

В 40—50-е гг. кардинально обострилась полемика Восточного вопроса. Октябрь 1853 г. Османская империя объявила России войну. 18 ноября 1853 г. в турецком порту Синоп эскадрой Черноморского Флота вице-адмирала Павла Степановича Нахимова (1802—1855) наголову был разгромлен турецкий флот. В начале Крымской войны, 6 ноября 1854 года, Пирогов вместе с возглавляемой им группой врачей и медсестёр выехал из Санкт-Петербурга на театр военных действий. Среди врачей были Э. В. Каде, П. А. Хлебников, А. Л. Обермиллер, Л. А. Беккерс, доктор медицины В. И. Тарасов и верный помощник Пирогова — фельдшер И. Калашников. Медсёстры, в обучении которых принял участие Пирогов, представляли Крестовоздвиженскую общину сестёр милосердия, только что учреждённую по инициативе великой княгини Елены Павловны. Пирогов был главным хирургом осаждённого англо-французскими войсками города Севастополя.

Оперируя раненых, Пирогов впервые в истории русской медицины применил гипсовую повязку, дав начало сберегательной тактике лечения ранений конечностей и избавив многих солдат и офицеров от ампутации. Во время осады Севастополя Пирогов руководил обучением и работой сестёр Крестовоздвиженской общины сестёр милосердия. Он распределил их на четыре группы: перевязочные, аптекарши, хозяйки, а также транспортные сёстры, которые сопровождали раненых до госпиталя. Это было нововведением по тем временам. Кроме того, сёстры занимались уборкой, готовили еду и контролировали интендантов. Из 250 сестёр милосердия, работавших в Севастополе, 17 погибли от ранений и болезней. О беспримерной деятельности сестёр Крестовоздвиженской общины и в память об их подвиге Пирогов написал «Исторический обзор действий Крестовоздвиженской общины сестёр попечения о раненых и больных в военных госпиталях в Крыму и Херсонской губернии с 1 декабря 1854 по 1 декабря 1856 года».

Важнейшей заслугой Пирогова стало внедрение в Севастополе совершенно нового метода сортировки раненых. Пирогов впервые в мире предложил распределять раненых по степени тяжести на пять категорий: 1) безнадёжные и смертельно раненые; 2) тяжело и опасно раненые, требующие безотлагательной помощи; 3) тяжёлые, способные пережить после оказания первичной помощи доставку в госпиталь; 4) подлежащие отправке в госпиталь и 5) легкораненые, которым помощь оказывается на месте (наложение лёгкой повязки или извлечение поверхностно сидящей пули). Из такой сортировки впоследствии выросла вся лечебно-эвакуационная служба армии. С большим трудом Пирогову удалось организовать работу военно-транспортных команд с лошадьми и удобными повозками, что позволяло довольно быстро доставлять раненых в госпиталь. Поэтому Пирогов по справедливости считается основоположником специального направления в хирургии, известного как военно-полевая хирургия.

За заслуги в оказании помощи раненым и больным во время этой войны Пирогов был награждён орденом Святого Станислава 1-й степени.

В 1855 году Пирогов был избран почётным членом Императорского Московского университета. В этом же году по просьбе петербургского врача Н. Ф. Здекауэра был принят и осмотрен Н. И. Пироговым бывший в то время старшим учителем Симферопольской гимназии Д. И. Менделеев, с юности испытывавший проблемы со здоровьем (подозревали даже у него чахотку). Констатируя удовлетворительное состояние пациента, Пирогов заявил: «Вы нас обоих переживёте» — предначертание это не только вселило в будущего великого учёного уверенность в благосклонности к нему судьбы, но и сбылось.

Несмотря на героическую оборону, Севастополь был частично взят осаждающими, и Крымская война была проиграна Российской империей.

Вернувшись в Петербург, Пирогов на приёме у Александра II рассказал императору о проблемах в войсках, а также об общей отсталости Русской императорской армии и её вооружения. После этой встречи предмет деятельности Пирогова изменился — он был направлен в Одессу на должность попечителя Одесского учебного округа. Такое решение императора можно рассматривать как проявление его немилости, но при этом Пирогову ранее уже была назначена пожизненная пенсия по 1849 рублей и 32 копейки в год.

1 января 1858 года Пирогов был повышен в чине до тайного советника, затем переведён на должность попечителя Киевского учебного округа, а в 1860 году удостоен ордена Святой Анны 1-й степени. Пирогов пытался реформировать сложившуюся систему образования. Однако действия и независимость Пирогова привели к конфликту с властями, и ему пришлось оставить должность попечителя Киевского учебного округа. 13 марта 1861 года Пирогов был назначен членом Главного правления училищ, а после его ликвидации в 1863 году, пожизненно состоял при Министерстве народного просвещения Российской империи.

Пирогова направили руководить обучающимися за границей русскими кандидатами в профессора. «За труды в бытность членом Главного правления училищ» Пирогову было сохранено содержание по 5 тысяч рублей в год.

Своей резиденцией Пирогов выбрал Гейдельберг, куда прибыл в мае 1862 года. Кандидаты с благодарностью вспоминали своего руководителя. Так, например, нобелевский лауреат И. И. Мечников подчёркивал, что Пирогов не только выполнял свои обязанности, часто выезжая в другие города, где учились кандидаты, но и оказывал им и членам их семей и друзьям любую, в том числе медицинскую, помощь. Так, один из кандидатов, глава русского землячества Гейдельберга, провёл сбор средств на лечение Джузеппе Гарибальди и уговорил Пирогова осмотреть раненого Гарибальди. От денег Пирогов отказался, но к Гарибальди поехал и обнаружил не замеченную другими всемирно известными врачами пулю и настаивал, чтобы Гарибальди покинул вредный для его раны климат, в результате чего итальянское правительство освободило Гарибальди из плена. По всеобщему мнению, именно Н. И. Пирогов тогда спас ногу, а, скорее всего, и жизнь «осуждённому» другими врачами Гарибальди. В своих «Мемуарах» Гарибальди вспоминает: «Выдающиеся профессора Петридж, Нелатон и Пирогов, проявившие ко мне великодушное внимание, когда я был в опасном состоянии, доказали, что для добрых дел, для подлинной науки нет границ в семье человечества…». После этого случая, вызвавшего фурор в Петербурге, произошли покушение на Александра II нигилистами, восхищавшимися Гарибальди, и, главное, участие Гарибальди в войне Пруссии и Италии против Австрии, что вызвало неудовольствие австрийского правительства. «Красный» Пирогов был освобождён от исполнения служебных обязанностей, но при этом сохранил статус чиновника и ранее назначенную пенсию.

В расцвете творческих сил Пирогов был отстранён и от государственной службы и от академической деятельности, он уединился в своём небольшом имении «Вишня» неподалёку от Винницы, где организовал бесплатную больницу. Он ненадолго выезжал оттуда только за границу, а также по приглашению Императорского Санкт-Петербургского университета для чтения лекций. К этому времени Пирогов уже был членом нескольких иностранных академий. Относительно надолго Пирогов лишь дважды покидал имение: первый раз — в 1870 году во время франко-прусской войны он был приглашён на фронт от имени Международного Красного Креста, и второй раз — в 1877—1878 годах, когда уже в пожилом возрасте несколько месяцев работал на фронте во время русско-турецкой войны. В 1873 году Пирогов был удостоен ордена Святого Владимира 2-й степени.

Когда император Александр II посетил Болгарию в августе 1877 года, во время Русско-турецкой войны, он вспомнил о Пирогове как о несравненном хирурге и лучшем организаторе медицинской службы на фронте. Несмотря на свой пожилой возраст (тогда ему исполнились уже 67 лет), Пирогов согласился отправиться в Болгарию при условии, что ему будет предоставлена полная свобода действий. Это желание было удовлетворено, и 10 октября 1877 года Пирогов прибыл в деревню Горна-Студена, недалеко от Плевны, где располагалась главная квартира русского командования в Болгарии.

Пирогов организовал лечение солдат, уход за ранеными и больными в военных больницах в Свиштове, Згалеве, Болгарене, Горна-Студена, Велико-Тырново, Бохот, Бяла, Плевне. С 10 октября по 17 декабря 1877 года Пирогов проехал свыше 700 км на бричке и санях по территории в 12 000 кв. км, занятой русскими между реками Вит и Янтра, посетив 11 русских военно-временных больниц, 10 дивизионных лазаретов и три аптечных склада, дислоцированных в двадцати двух населённых пунктах. За это время он занимался лечением и оперировал как русских солдат, так и многих болгар. В 1877 году Пирогов был награждён орденом Белого орла и украшенной бриллиантами золотой табакеркой с портретом Александра II.

В 1881 году Пирогов стал пятым почётным гражданином Москвы «в связи с пятидесятилетней трудовой деятельностью на поприще просвещения, науки и гражданственности». Член-корреспондент Императорской Санкт-Петербургской академии наук (ИАН) (1846), Императорской Медико-хирургической академии (1847, почётный член — с 1857 года) и Германской академии естествоиспытателей «Леопольдина» (1856).

В начале 1881 года Пирогов обратил внимание на боль и раздражение на слизистой твёрдого нёба. 24 мая 1881 года Н. В. Склифосовский установил наличие у Пирогова рака верхней челюсти. Н. И. Пирогов умер 23 ноября 1881 года в 20 часов 25 минут в селе Вишня (ныне — часть города Винница). По воспоминаниям его сына, перед началом агонии Н. И. Пирогова «началось лунное затмение, окончившееся сразу после развязки».

Пирогов менее чем за месяц до смерти (27 октября 1881 года) сам поставил себе неутешительный диагноз. После его смерти в бумагах была обнаружена записка: «Ни Склефасофский (так написано в оригинале), Валь и Грубе, ни Бильрот не узнали у меня ulcus oris men. mus. cancrosum serpeginosum (лат. — ползучая перепончатая слизистая раковая язва рта), иначе первые трое не советовали бы операции, а второй не признал бы болезнь за доброкачественную».

27 ноября (9 декабря) 1881 года в течение четырёх часов тело Пирогова было забальзамировано Д. И. Выводцевым в присутствии двух врачей, двух фельдшеров и священника (предварительно было получено разрешение от церковных властей, «учтя заслуги Н. И. Пирогова как примерного христианина и всемирно известного учёного, разрешили не предавать тело земле, а оставить его нетленным, „дабы ученики и продолжатели благородных и богоугодных дел Н. И. Пирогова могли лицезреть его светлый облик“») и было погребено в усыпальнице в его усадьбе Вишня (ныне — часть Винницы). Через три года над усыпальницей была построена церковь, проект которой разработал В. И. Сычугов.

В конце 1920-х годов в склепе побывали грабители, которые повредили крышку саркофага, украли шпагу Пирогова (подарок Франца Иосифа) и нательный крест. В 1927 году специальная комиссия указала в своём отчёте: «Драгоценным останкам незабвенного Н. И. Пирогова, благодаря всеуничтожающему действию времени и полной беспризорности, грозит несомненное разрушение, если существующие условия будут продолжаться».

В 1940 году при вскрытии гроба с телом Н. И. Пирогова было обнаружено, что обозреваемые части тела учёного и его одежда во многих местах покрыты плесенью; останки тела мумифицировались. Тело из гроба не извлекали. Основные мероприятия по сохранению и восстановлению тела планировались на лето 1941 года. В начале Великой Отечественной войны при отступлении советских войск саркофаг с телом Пирогова был скрыт в земле и при этом повреждён. Это привело к порче тела, впоследствии подвергнутого реставрации и неоднократному ребальзамированию. Большую роль в этих мероприятиях сыграл Е. И. Смирнов.

Официально гробница Пирогова именуется как «церковь-некрополь». Тело Пирогова находится несколько ниже уровня земли в крипте — цокольном этаже православного храма, в застеклённом саркофаге, к которому открыт доступ всем желающим отдать дань уважения памяти великого учёного.